□ 王丽娟 王小妮
摘要：目的：建立灵芝质量可靠且经济的灭菌方法。方法：采用热压灭菌、微波灭菌、紫外线灭菌、干热灭菌和环氧乙烷气体灭菌方法对同一批灵芝灭菌，采用高效液相色谱法测定不同灭菌方法对灵芝中灵芝多糖含量的影响。结果：环氧乙烷灭菌法可作为灵芝可靠且经济的灭菌方法。
引言
灵芝为灵芝科(Ganodermatacea
e)真菌赤 Ganoderma lucidum(W.Curt.Fr.)Karst的干燥子实体 。灵芝一般生长在湿度高且光线昏暗的山林中，主要生长在腐树或是其树木的根部 。灵芝是一种坚硬、多孢子和微带苦涩的菌类植物，当达到成熟期的灵芝就会喷出粉状的孢子，从而进行繁殖。
灵芝的药理成分非常丰富，其中有效成分可分为十大类，包括灵芝多糖、灵芝多肽、三萜类、16种氨基酸(其中含有七种人体必需氨基酸)、蛋白质、甾类、甘露醇、香豆精苷、生物碱、有机酸（主含延胡索酸），以及微量元素Ge、P、Fe、Ca、Mn、Zn等。灵芝对人体具有双向调节作用，研究表明灵芝具有滋养强壮、调节免疫、抗衰老等多种药理作用，所治病种，涉及心脑血管、消化、神经、内分泌、呼吸、运动等各个系统，尤其对肿瘤、肝脏病变、失眠以及衰老的防治作用十分显著。现代药理和临床试验证明，灵芝对多种疾病具有十分显著的疗效 。其中灵芝多糖被认为是灵芝扶正固本的主要有效成分之一 。由于灵芝打成药粉入药时，需要在入药前对灵芝粉进行灭菌并进行微生物限度检查，为考察灭菌方法对灵芝成分的影响，故采用灵芝多糖作为指标成分，本文采用热压灭菌、微波灭菌、紫外线灭菌、干热灭菌和环氧乙烷气体灭菌方法对同一批灵芝进行灭菌，采用高效液相色谱法测定了不同灭菌方法对灵芝中灵芝多糖含量的影响，实验结果如下。
1、实验部分
1.1仪器与试药
Agilent1100高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司），VWD紫外检测器，Agilent化学工作站。KQ-600B超声波清洗仪，热压灭菌锅，紫外灯。D-无水葡萄糖对照品由中国药品生物制品检定所提供，批号为110833－20050，硫酸、无水乙醇为分析纯，环氧乙烷。灵芝为我校食用菌实验室自己培育。
1.2灭菌方法原理
热压灭菌法(autoclave sterilization)利用饱和蒸汽的湿热在一定压力下所释放的潜热杀灭病原微生物、细菌繁殖体、芽胞和病毒的方法。特点：温度高、穿透力强，效果可靠热力消毒灭菌法。
微波灭菌法使菌体蛋白受热变性，破坏核酸及酶的活性，特点：穿透力强，简单方便。
紫外线灭菌法利用紫外线，使菌体蛋白质光解变性而死亡。常用紫外线灯管消毒法，最佳杀菌波长：253.7nm ；有效距离：物品：25～60cm, 空气：小于2m；照射时间 ：灯亮 5～7min后开始计算应大于30min ；适用：室内空气、物体表面 ；特点：简单、方便、无损物品。
干热消毒灭菌法 ： 是利用热力破坏微生物的蛋白质、核酸、酶、细胞壁和细胞膜等，从而达到灭菌的目的。
环氧乙烷气体消毒使菌体蛋白凝固变性，干扰细胞酶的活性，改变细胞膜通透性，适用于不宜使用高温消毒、耐湿的物品， 特点：穿透力强，毒性大、易燃易爆不宜使用高温消毒、耐湿的物品。
1.3 灵芝粉的制备
取灵芝80~100℃干燥后，于-10~-15℃冰箱冷冻后立即粉碎成80~100目细粉。
1.4 不同灭菌方法灵芝粉样品的制备
取灵芝粉，分装在牛皮纸袋中，分别采用热压灭菌、微波灭菌、紫外线灭菌、干热灭菌和环氧乙烷气体灭菌。
1.5 样品不同灭菌方法的微生物限度检查结果(见表1)
将原粉定为样品1，热压2、微波3、紫外4、干热5和环氧乙烷6，微生物限度检查方法为平皿法。
表1结果表明，灵芝环氧乙烷灭菌方法灭菌效果较好。
1.6不同灭菌方法灵芝的含量测定
1.6.1色谱分析原理
用十八烷基键合硅胶为填充剂；XDB-C18柱(4.6 mm×200 mm, 5μm )；硫酸-水（ (6：1000)为流动相；检测波长为200nm，流速0.6ｍl/min，进样量20μl，柱温30℃；理论板数按D-无水葡萄糖峰计算应不低于3000。
1.6.2对照品溶液的制备
精密称取减压干燥48小时的D-无水葡萄糖对照品适量，加流动相制成每1ml含2mg的溶液，滤过，即得。
1.6.3 供试品溶液的制备
分别取各种灵芝粉末1.0g，精密称定，置10ml的离心管中，加正已烷8ml，振摇2min后，离心(3000r/min)10min，弃去正已烷层，再重复上述步骤一次，水浴挥去残留正已烷，转移至10ml量瓶中，加水适量，100℃水浴加热1h，补足水分至刻度，混匀，滤过，取续滤2.0ml，置10ml的离心管中，加无水乙醇8.0ml，摇匀并放置2min，离心(3000r/min)10min，弃去上清液，沉淀物用2.0ml流动相100℃水浴水解1h，即得。
1.6.4 测定
分别精密吸取对照品溶液与各种供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得，将原粉定为样品1，热压2、微波3、紫外4、干热5和环氧乙烷6，结果见表2。
表2结果表明，灵芝环氧乙烷灭菌方法灭菌较好。
2、结果与讨论
实验结果表明，热压灭菌效果好，但对其成分影响大；微波和干热灭菌法效果一般且对其成分影响较大；紫外线对灵芝成分影响几乎可以忽略，但其只使用与物体表面，灭菌效果不理想：环氧乙烷灭菌效果好又对其成分影响极小。分析实验可知，灵芝的环氧乙烷灭菌方法对灵芝多糖含量影响较小，故为保证灵芝的质量，在药材灭菌时应采用环氧乙烷灭菌方法较好。
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